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引言

肿瘤由细胞和非细胞成分构成，其结构跨越多种空间尺度，从微米延展到厘米。近年来，随着高倍多重空间分析技术的不断开展，BWIN必赢智慧对这些复杂结构的理解大大加深。图像基础上的空间分析技术，使得研究人员可以在单一样本中，对多达百万级别的细胞如何分布以及数十种蛋白质的空间强度进行解析。这些技术对于揭示肿瘤微环境中细胞的异质性以及细胞间的复杂互动至关重要。然而，组织图像中不可避免的伪影问题，例如折叠、碎屑、抗体聚集和光学畸变，会明显干扰单细胞数据的质量与其生物学解释，可能导致误导性的结论。为分析决这些挑战，发表于10月30日的《Nature Methods》研究中介绍了一款名为“CyLinter”的交互式质量控制工具。该工具能够有效识别并去除图像中的伪影数据，从而大幅提升单细胞分析的质量，尤其在面对长时间保存的存档样本时。

顺利获得感光成像技术（如MxIF、CyCIF、CODEX等），科学家得以在两维与三维组织环境中解析出20至100种蛋白质与其他生物分子的存在。与解离方法如单细胞RNA测序（scRNA-seq）相比，这些成像技术不仅可保留细胞的空间背景信息，还可从福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本中挖掘高价值数据，这对理解肿瘤细胞在微环境中的行为以及免疫细胞如何渗透并与肿瘤细胞互动有极高的应用价值。

然而，从高度多重图像生成单细胞数据需要进行图像分割，这一过程容易受到多种伪影的干扰，影响数据质量及生物学推断的准确性。伪影的存在可能导致细胞类型的错误分类，还可能掩盖真实且重要的细胞间互动。因此，有效的质控对于保证单细胞水平的数据质量至关重要。

CyLinter工具的开发与模块化应用

为分析决高度多重组织成像中伪影问题，研究团队开发了名为CyLinter的质控工具。这是一款集成在Python环境下的Napari图像查看器中的交互式软件，帮助用户识别并去除因显微伪影导致的单细胞数据偏差。CyLinter目标是利用多种质控手段尽可能提高数据准确性，使得研究人员能够针对肿瘤样本中的细胞特征和空间关系进行准确的分析。

CyLinter的工作流程包含几个关键模块：

·       区域选择模块（ROI selection）：用户可手动选择图像中伪影区域，随后分析时这些区域的数据将被去除。对于伪影较多的数据集，CyLinter还给予正选择模式，允许用户选择完整区域进行保留。软件中集成了自动化算法，可程序化标记潜在伪影以供人工审核。结合半自动和手动质控方式，CyLinter确保用户标记准确，去除所有可能影响分析结果的伪影区域。

·       DNA强度分析模块（dnaIntensity）：可检查每个细胞核的平均强度分布。强度过低可能意味着细胞核被切片或不在焦平面内，强度过高可能指染色过饱和或组织折叠。用户可调整阈值去除这些异常数据。DNA强度的分布对于组织完整性和分割精确度给予了重要参考价值，尤其在样本处理过程中可能引入变异。

·       细胞分割面积过滤模块（dnaArea）：用于识别和去除在分割过程中超出或不足分割的细胞。这个模块在结直肠癌（CRC）图像中能有效去掉过度分割的细胞。面积的异常分布可能由成像伪影、分割错误或样本制备问题引起，确保分割后数据的准确性至关重要。

·       成像周期相关性模块（cycleCorrelation）：由于组织移动或降解，某些细胞在多轮成像过程中可能会丢失。该模块通过计算第一个与最后一个成像周期之间的DNA强度比值来识别不稳定的细胞。这种周期相关性检查在多轮成像数据集中尤为重要，因为组织移动或成像质量变化可能导致信息丢失或偏移，影响定量分析。

·       通道离群值修剪模块（pruneOutliers）：用于可视化每个细胞的信号，基于上下百分位数阈值去除残留伪影（如小的抗体聚集）。离群值通常代表染色过程中抗体非特异性结合或样本中的技术性噪音，通过去除这些离群信号，可以显著提高数据准确性。

这些模块的协同应用使得CyLinter能够执行全面的质量控制，确保去除伪影后的数据具备更高的可靠性与准确性。每一个模块都可以独立应用于特定的质控需求，它们的组合使用使得质控过程更为灵活和高效。

多种影响组织切片免疫荧光图像质量的伪影，这些伪影影响了基于组织衍生的单细胞数据的分析。举例来说，在大肠样本中发现了因组织折叠产生的伪影区域，正常扁桃体的CD63通道中观察到了抗体聚集等，这些都影响了单细胞数据质量。

CyLinter的应用效果与实证分析

在研究中，CyLinter被用于多个数据集，包括来自TOPACIO临床试验的乳腺癌和卵巢癌样本，以及结直肠癌（CRC）样本。借助CyLinter的质控处理，研究人员显著提高了单细胞数据质量。例如，在CRC数据集中，约23%的细胞被移除，大部分由于过度分割而形成的伪影。质控后的数据集生成了78个细胞簇，更能细致准确地反映生物学特征。

在TOPACIO数据集中，CyLinter去除了约84%的细胞，其中53%顺利获得正选择模式去除。此外，约14%的细胞因抗体聚集导致信号过强被移除，12%因成像周期中组织移动丢失，4%因分割错误去除，1%因DNA染色过饱和或强度过低被删除。质控后的数据集包含43个细胞簇，其聚类质量的Silhouette评分大部分为正值，表明质控后的数据具有更好的聚类效果。

质控后，TOPACIO数据集展示了显著的细胞簇间差异，肿瘤细胞往往按照患者分组，而免疫细胞则展现出更大的异质性。利用CyLinter的各个模块，确认大多数细胞形态与标记表达符合已知细胞类型。质控后簇42主要由不含DNA损伤的肿瘤细胞组成，而簇21包含有γH2AX标记的DNA受损肿瘤细胞。这些明确的分离为后续分析给予了重要基础，尤其在研究治疗反应与肿瘤进展机制时。

顺利获得CyLinter的过滤模块，研究人员识别并去除了多个数据集的伪影。例如，在TOPACIO数据集中，FOXP3通道中30%以上的图像瓦片受到非特异性抗体信号条纹影响。顺利获得手动与自动化质控过程结合，成功去除伪影，提高后续单细胞分析的可靠性。质控在临床样本研究中尤为重要，因为样本异质性与处理步骤变化可能导致技术性噪声的加重，进而影响数据解释和生物学推断。

CyLinter的开发为高倍多重组织成像数据的质控给予了一种可靠高效的方法。顺利获得去除实验与成像过程中的伪影，CyLinter显著提高了单细胞数据的准确性，使得研究人员能够更准确地解读复杂的生物现象。在癌症微环境研究中，高质量的单细胞数据对于理解肿瘤进展、免疫逃逸及细胞间互动至关重要。CyLinter的应用不仅改善了现有数据集的质量，还为未来实验设计给予了质控思路与工具支持。

CyLinter为自动化伪影检测的深度学习模型给予了理想的训练数据。随着人工智能技术的开展，基于深度学习的伪影检测方法有望实现更高效、精准的质控过程。未来研究团队计划公开CyLinter质控报告中的伪影库，扩展伪影检测能力，有助于该领域开展。这一举措将为研究领域给予宝贵资源，促进标准化质控流程的建立，提高多重成像技术的再现性与可靠性。

总体而言，CyLinter的应用显著提升多样化组织成像数据分析精度，为揭示复杂组织结构中的生物机制，尤其是肿瘤微环境研究，给予了重要技术支持与方法创新。顺利获得改进和扩展，CyLinter将持续有助于单细胞水平空间生物学研究，助力解析肿瘤及其他复杂组织的动态变化，为精准医疗给予科学依据。伴随未来更多数据集质控与伪影库完善，CyLinter有望成为高度多重成像领域的标准工具，引领复杂组织单细胞研究进入新的开展阶段。

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